как узнать свой пцр тест
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.
ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.
Суть метода ПЦР
ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.
Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.
Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.
Преимущества метода ПЦР
Какие есть недостатки
Показания к проведению ПЦР-анализа
Подготовка к проведению ПЦР-теста
Как проводится ПЦР-анализ
Результаты ПЦР-теста
Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.
Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.
Обзор методов тестирования на COVID-19: предупрежден – значит вооружен!
Статистика по новым случаям заболевания COVID-19 снова бьет неутешительные рекорды. В начале октября власти Москвы были вынуждены вернуть часть ограничений, чтобы постараться хоть как-то сдержать новую вспышку распространения коронавирусной инфекции
Дети отправлены на двухнедельные каникулы, не менее 30% сотрудников столичных предприятий вновь переведены на удаленную работу, приостановлен льготный проезд для школьников и пенсионеров в общественном транспорте.
Столичный градоначальник Сергей Собянин призвал москвичей с пониманием отнестись к решениям, которые принимаются для борьбы с распространением коронавируса. По его словам, соблюдение масочного режима и других требований поможет приостановить нарастающую волну эпидемии.
При этом, судя по всему, и федеральные, и региональные власти надеются не допустить возвращения к полному локдауну, который может стать очередным ударом для бизнеса и доходам граждан.
О важности тестирования
Пока первая в мире зарегистрированная вакцина Sputnik V проходит третью фазу клинических испытаний, которые должны окончательно подтвердить ее эффективность и безопасность против новой коронавирусной инфекции, одним из главных инструментов борьбы с пандемией остается качественная и своевременная диагностика заболевания.
Знать свой COVID-статус сегодня, как никогда, важно, особенно если вы продолжаете вести активный образ жизни. Это поможет защитить себя, своих близких и просто окружающих людей из так называемых групп риска (пожилых людей, хроников, беременных женщин), с которыми вы можете столкнуться, например, в супермаркете или в очереди в поликлинику.
Однако у простого обывателя здесь возникает множество разумных вопросов. Кому и с какой периодичностью необходимо сдавать такие тесты? На каком виде исследований остановиться (на сегодняшний день Росздравнадзором зарегистрировано уже почти две сотни диагностических тестов на ковид)? В каком случае тест можно сдать бесплатно по ОМС, а в каком имеет смысл обратиться в платную лабораторию? Насколько в принципе результаты тестирования достоверны?
Обнаружить следы вируса
Давайте попробуем вместе последовательно разобраться в способах забора анализов и методах лабораторной диагностики SARS-CoV-2.
Прежде всего надо сказать, что все классические тесты на SARS-Cov-2 делятся на две большие категории:
— Первая группа тестов нацелена на обнаружение генетического материала (РНК) вируса.
— Вторая группа – это тесты на определение антител.
Согласно временным рекомендациям Минздрава России, ПЦР-тестирование является обязательным и бесплатным для: 1) прибывающих из-за рубежа с признаками респираторных заболеваний; 2) тех, кто имел контакты с больными COVID-19; 3) пациентов с диагнозом «внебольничная пневмония»; 4) работников медицинских организаций (не менее одного раза в неделю); 5) лиц старше 65 лет с признаками респираторных заболеваний и еще для некоторых категорий граждан.
Кроме того, если у вас появились симптомы ОРВИ в любой другой ситуации, то стоит позвонить в поликлинику и вызвать врача на дом для проведения тестирования.
Каждые две недели тестировать на коронавирус методом ПЦР не менее 10% сотрудников, которые ходят на работу, также обязаны столичные работодатели. Такие анализы обычно берутся непосредственно в офисе, а затем отправляются в лабораторию.
В частных клиниках и лабораториях ПЦР-анализ могут сдать только люди, не имеющие явных симптомов ОРВИ и не контактировавшие в последнее время с больными с подтвержденным COVID-19.
Поэтому к ним для сдачи ПЦР преимущественно обращаются люди, которым по тем или иным причинам нужна официальная справка, подтверждающая, что они не больны ковидом.
Биологическим материалом для ПЦР-исследования является отделяемое из носоглотки и ротоглотки.
При этом корректность результата во многом зависит от правильности подготовки к тестированию и забора материала.
Поэтому примерно за три часа до анализа не рекомендуется есть или чистить зубы. Чтобы взять мазок, врач должен провести по вашему нёбу и внутренней поверхности носа специальной стерильной палочкой, запечатать образец в контейнер и отправить на исследование в специальную лабораторию.
При использовании метода ПЦР исследование длится несколько часов, но пациенты, как правило, получают результаты анализа на руки в течение 1–3 дней.
Диагностика методом изотермической амплификации требует меньше времени.
Экспресс-тестирование для определения присутствия в организме вируса на сегодняшний день применяется, например, в аэропорту Шереметьево, для прилетающих из-за рубежа, а также используется в некоторых родильных домах при поступлении рожениц.
Болел или не болел?
А теперь чуть подробнее поговорим о тестах на определение антител.
Этот вид диагностики является вспомогательным для диагностики текущей коронавирусной инфекции, а также позволяет определить, встречался ли человек с ней ранее.
Сам вирус такие тест-системы не ищут. Они ищут антитела (IgА, IgМ, IgG) к белкам нуклеокапсида и оболочки вируса.
Антитела класса A (IgA) начинают формироваться и доступны для детекции примерно со 2 дня от начала заболевания, достигают пика через две недели, но долго не сохраняются. Антитела класса M (IgM) начинают выявляться примерно на 7-е сутки от заражения, достигают пика через неделю и могут сохраняться в среднем до 6 недель. Примерно со 2-3-й недели или ранее определяются антитела класса G(IgG).
Кровь на антитела берут из вены (в лаборатории, офисе или дома), как правило, без привязки к приему пищи.
Массовое тестирование на антитела полезно преимущественно с точки зрения сбора статистических данных, оно помогает эпидемиологам понять, сколько людей уже реально переболело в конкретном регионе и какие группы населения могут быть потенциальными переносчиками коронавирусной инфекции.
Однако основной недостаток таких тест-систем заключается в том, что они могут гарантированно подтвердить лишь сам факт встречи организма с вирусом, но не наличие сформированного протективного иммунитета.
Истинные «охотники за коронавирусом»
Сейчас уже достоверно известно, что иммунитет к SARS-CoV-2, особенно после перенесенного в легкой форме заболевания, может оказаться нестойким. И в России, и за рубежом уже есть официально зарегистрированные случаи повторного заражения.
Но отчаиваться не стоит. Нужно просто лучше понять, каким образом SARS-CoV-2 атакует организм, и иметь в виду, что не все вырабатываемые антитела одинаково полезны в борьбе с ним.
Итак, атака вируса начинается с того, что он связывает свой S-белок с белками человеческой клетки и, таким образом, обманывая рецептор, проникает вовнутрь. Если быть чуть точнее, надо сказать, что вирус контактирует с клеткой не всей поверхностью белка, а только его концом, так называемым рецептор-связывающим доменом (Receptor-binding domain, или RBD). Под микроскопом этот домен напоминает те самые шипы, делающие вирус похожим на солнечную корону во время затмения.
Актуальные исследования показывают, что все анти-RBD антитела, вырабатываемые при естественной встрече с коронавирусом, являются вируснейтрализующими. Они блокируют попадание вируса в клетку, нарушив его контакт с клеточным рецептором, и могут защитить уже переболевшего от повторного заболевания.
Тем не менее анти-RBD антитела могут не выработаться в достаточном количестве в результате перенесенного заболевания, а со временем их концентрация в плазме и вовсе снижается. Поэтому даже если вы знаете наверняка, что вы или члены вашей семьи уже болели коронавирусом или у вас есть положительный результат обычного анализа на антитела IgG – это еще не означает, что вы все еще 100% защищены от повторного заражения.
Хорошая новость заключается в том, что недавно на рынке появились новые тест-системы, разработанные Национальным исследовательским центром эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, которые помогают определить наличие в крови именно вируснейтрализующих анти-RBD антител.
В то время как анализ ПЦР определяет наличие вируса в организме на данный момент, а обычное тестирование крови на наличие антител IgG и IgM позволяет сделать вывод о том, был ли у человека в принципе контакт с коронавирусом, тест-системы нового поколения Центра им. Гамалеи предметно отвечают на вопрос о том, сформирован ли в результате перенесенного заболевания протективный (защитный) иммунный ответ, который позволит человеку избежать заражения в будущем.
«По наличию антител класса M можно судить о том, что человек недавно был инфицирован вирусом. По наличию антител класса G можно говорить, что уже две-три недели прошло с того момента, как человек был инфицирован коронавирусом. Наша тест-система третьего поколения, мы ее так называем, среди всех антител класса G выявляет только те, которые непосредственно нейтрализуют вирус», – рассказывает директор Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Александр Гинцбург.
«Мы взяли этот белок (S-белок) как мишень и при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) ведем поиск, есть ли у человека в крови такие антитела, которые способны заблокировать проникновение вируса в клетки», – более подробно объясняет принцип работы теста руководитель лаборатории иммунобиотехнологии Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Дмитрий Щебляков.
Точность таких анализов близка к 100%. Поэтому, если наличие анти-RBD антител будет выявлено, то в течение по крайней мере ближайших нескольких месяцев вы сможете спать спокойно, зная, что ковид вам не грозит.
Единственный минус заключается в том, что пока такие анализы проводятся только в некоторых частных клиниках и лабораториях Москвы и Московской области. Но в будущем они наверняка получат более широкое применение, ведь в действующей восьмой версии Временных методических рекомендаций Минздрава России «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)» уже сказано, что проведение иммуноферментного анализа для определения анти-RBD антител рекомендуется для оценки напряженности поствакцинального протективного иммунитета.
«Цена ошибки высока». От чего зависит результат ПЦР-тестов на коронавирус
МОСКВА, 6 дек — РИА Новости, Татьяна Пичугина. Недавняя публикация ученых из Сеченовского университета о том, что почти половина анализов на возбудителя COVID-19 не дают реальной картины, вызвала множество вопросов. Насколько точны ПЦР-тесты и нужны ли они для диагноза? РИА Новости разбирается в ПЦР-диагностике и почему в нее закрадываются ошибки.
Как выявляют вирус в организме
«Тяжело заболел наш сотрудник. Поднялась высокая температура, положили в больницу. Все признаки COVID-19, — рассказывает Алексей Чемерис, доктор биологических наук, профессор, сотрудник Института биохимии и генетики Уфимского ФИЦ РАН. — А ПЦР-анализ, который ему сделали в специальном медицинском центре наши коллеги-профессионалы, как только он почувствовал недомогание, — отрицательный. Видимо, в тот момент у больного было мало вирусных частиц в организме — за пределами чувствительности теста».
Ученые называют такие результаты ложнонегативными — инфекция проявляется внешне, а тест на возбудителя — «чистый». Тут дело и в самом методе, и в его массовом применении.
Когда медсестра берет мазок из ротоглотки и носоглотки, на кончике зонда остается немного влаги, а в ней — клетки эпителия. Зонд опускают в пластиковую пробирку с раствором (эппендорф) и кончик отламывают, чтобы закрыть емкость. В лаборатории ее помещают в центрифугу, проводят ряд манипуляций для выделения из клеток фрагментов вирусного генома. В случае с COVID-19 — это РНК коронавируса SARS-CoV-2.
В образовавшийся раствор добавляют праймеры — искусственные участки генома коронавируса, именно они опознают SARS-CoV-2, и один из них служит затравкой для синтеза цепочки ДНК под действием определенного фермента на основе механизма обратной транскрипции. Фактически получается ДНК-копия участка коронавируса, которую уже можно размножать. Для этого запускают ПЦР — полимеразную цепную реакцию. За несколько десятков циклов она увеличивает число копий ДНК, а специальный флуоресцентный краситель подсвечивает их в пробирке, сигнализируя о вирусе. Если в биоматериале нет вирусных частиц, ампликонов (продуктов ПЦР) не будет вовсе, результат — отрицательный. Если вируса очень мало, итоговое количество ампликонов по завершении ПЦР окажется за пределами чувствительности прибора и результат — ложноотрицательным.
Тонкости метода
В ПЦР-диагностике много нюансов, объясняет Алексей Чемерис. В лаборатории для научных целей выявляют даже единичные копии вирусного генома в образце, при массовом применении чувствительность обычно на порядки ниже.
«Из-за случайных мутаций генома праймеры могут не сработать, если однонуклеотидные замены или даже более значительные изменения генома вируса пришлись как раз на эти участки. Вероятность невысока, но она есть», — отмечает ученый.
Возможны сбои при ручных операциях, которых не так много. Одна из них — извлечение вирусной РНК из образца. Автоматический экстрактор нуклеиновых кислот стоит довольно дорого, поэтому обычно эту процедуру доверяют лаборанту. Редко, но ложноположительные результаты случаются, в том числе из-за особенностей ПЦР или загрязнения образца.
Чаще всего, однако, проблемы возникают до того, как пробирка попала в лабораторию. Вот что пишут авторы статьи в журнале «Вестник Росздравнадзора»: «В настоящее время имеются неопровержимые доказательства того, что преаналитическая фаза является основным источником ошибок в лабораторных исследованиях, когда они используются для диагностических или исследовательских целей». Они публикуют целый список нарушений, ведущих к ложноотрицательным результатам.
Ключевой этап — подготовка к исследованию. «За три часа до анализа нельзя есть, пить, курить и полоскать рот. Дело в том, что коронавирус поражает клетки слизистой оболочки дыхательных путей. Проникая в них, он начинает размножаться, накапливается на их поверхности. Но есть еще и эпителиальные клетки, которые часто обновляются. Вместе с водой, едой и избытком слюны при курении и жевании жвачки эпителиальные клетки попадают в пищевод. В результате вероятность обнаружить вирус в мазке падает практически до нуля», — комментирует Тамара Силкина, врач клинической лабораторной диагностики, директор по лабораторным технологиям «Гемотеста».
Не менее важна процедура взятия биоматериала. Если неверно выбрать точку для мазка, например, из-за кашля или рвотного рефлекса, на зонд может не попасть достаточное количество клеток. На результат также влияют нарушения технологии хранения, транспортировки образцов.
«Цена ошибки очень высока — процент выявляемости коронавирусной инфекции снизится, а скорость ее распространения вырастет. Люди, получившие ложноотрицательные результаты, будут чувствовать себя спокойно, выходить в общественные места и контактировать с окружающими», — уточняет представитель «Гемотеста».
Ключевой этап — подготовка к исследованию. «За три часа до анализа нельзя есть, пить, курить и полоскать рот. Дело в том, что коронавирус поражает клетки слизистой оболочки дыхательных путей. Проникая в них, он начинает размножаться, накапливается на их поверхности. Но есть еще и эпителиальные клетки, которые часто обновляются. Вместе с водой, едой и избытком слюны при курении и жевании жвачки эпителиальные клетки попадают в пищевод. В результате вероятность обнаружить вирус в мазке падает практически до нуля», — комментирует Тамара Силкина, врач клинической лабораторной диагностики, директор по лабораторным технологиям «Гемотеста».
Не менее важна процедура взятия биоматериала. Если неверно выбрать точку для мазка, например, из-за кашля или рвотного рефлекса, на зонд может не попасть достаточное количество клеток. На результат также влияют нарушения технологии хранения, транспортировки образцов.
«Цена ошибки очень высока — процент выявляемости коронавирусной инфекции снизится, а скорость ее распространения вырастет. Люди, получившие ложноотрицательные результаты, будут чувствовать себя спокойно, выходить в общественные места и контактировать с окружающими», — уточняет представитель «Гемотеста».
О точности диагностики
В России одобрены к использованию десятки тест-систем для выявления коронавируса. Ключевые характеристики — диагностические специфичность (точность) и чувствительность. Первый параметр показывает способность набора определить конкретный вирус. Второй — возможность обнаружить его части, даже если в биоматериале их очень мало. «Чем эти параметры ближе к ста процентам, тем лучше», — подчеркивает Тамара Силкина.
«Порог чувствительности — общий как для российских, так и для зарубежных тестов: 10³ на миллилитр. То есть должно быть не менее тысячи вирусных геном-эквивалентов на миллилитр образца. «ДНК-технология» заявила о чувствительности 10¹ — десять вирусных единиц на миллилитр. Другой важный показатель — воспроизводимость, то есть возможность получить одинаковый результат в разных условиях. Нужно учитывать и сходимость — отсутствие существенных различий между измерениями, выполненными в одинаковых условиях», — добавляет медик.
Метод ПЦР с обратной транскрипцией хорошо отработан и практически полностью автоматизирован. С момента попадания в лабораторию анализ занимает четыре-шесть часов. В мире эти тесты буквально поставили на поток. Только в Москве, по официальным данным, сделали 12 миллионов анализов.
Поскольку этот метод прямо выявляет возбудителя в организме, его относят к доказательной медицине и рекомендуют учитывать в клинической практике. Однако анализ больших данных говорит, что при массовом использовании ПЦР-тесты часто промахиваются.
Ложнонегативные результаты получаются в 20-66 процентах случаев. Такие данные из литературы приводят исследователи из Сеченовского университета. Вместе с зарубежными коллегами они изучили записи пациентов, госпитализированных в университетскую клинику в апреле — мае. Из 3480 человек, чьи ПЦР-тесты были доступны, примерно половина оказались чистыми. В то же время клиническая картина и КТ легких указывали на коронавирусную инфекцию. Авторы допускают, что в реальной клинической практике ПЦР-анализ не столь и критичен.
«Этиологическая диагностика, которая выявляет причину заболевания, нужна априори, — не соглашается Айрат Мавзютов, заведующий кафедрой фундаментальной и прикладной микробиологии, профессор кафедры лабораторной диагностики Башкирского государственного медицинского университета, руководитель Исследовательского центра «Лаборатория». — При вирусных инфекциях других, сравнимых по чувствительности и специфичности (точности), методов, кроме ПЦР-тестирования, нет».
Важно понимать, объясняет профессор Мавзютов, что клинический диагноз опирается на субъективные данные — анамнез (опрос) и осмотр пациента. На их основании невозможно установить вирусную природу заболевания и тем более какой именно возбудитель его вызвал. Для этого проводятся лабораторные исследования. Получаемые при этом данные, продолжает ученый, намного объективнее, поскольку большинство современных методов лабораторных исследований автоматизировано. Соответственно, на результаты не повлияют случайные факторы: уровень подготовки специалистов, их настроение, «погода в доме» и так далее.
«Диагноз COVID-19 можно поставить, только когда в материале от больного обнаружили РНК вируса SARS CoV-2 методом ПЦР или же антигены этого вируса иммунохимическими методами. Не выявив следов вируса в организме, нельзя говорить о «ковидной» природе заболевания или летального исхода», — утверждает Айрат Мавзютов.
Он обращает внимание на еще один аспект. ПЦР-тест не отличает РНК вируса, способного к репродукции, то есть размножению, от обломков «нежизнеспособных» вирусных частиц. Он лишь позволяет понять, присутствует или нет РНК коронавируса в клетках.
«Пока инфицированные клетки не заменятся на новые, а на это уходит от двух до четырех недель, не исключены положительные результаты. При этом вирус может быть уже «мертвым», человек здоров и никому не опасен», — отмечает профессор. Для уточнения учитываются данные целого ряда дополнительных исследований, позволяющих на лабораторном уровне оценивать остроту воспалительного процесса или образование антител на стадии его завершения.
Альтернатива ПЦР-диагностике
В любом случае нужно повышать чувствительность тест-систем на основе ПЦР, заключает Алексей Чемерис, а для этого нужны другие подходы. «Надо сделать так, чтобы ложнонегативных результатов было меньше, практически исключить их», — считает он.
В обзоре, подготовленном вместе с коллегами, профессор Чемерис рассматривает преимущества и недостатки ПЦР-диагностики и других методов амплификации — копировании РНК бетакоронавирусов, к которым относится SARS-CoV-2. Теоретически весьма перспективен метод петлевой амплификации — LAMP, где используют сразу шесть или восемь праймеров.
«С одной стороны, повышается специфичность: только когда все праймеры отожгутся (сработают, распознав РНК коронавируса. — Прим. ред.), начнется амплификация, с другой — вирус мутирует и шансы, что реакция не пойдет, увеличиваются, поскольку какие бы участки генома ни выбрать, все равно вероятность мутаций больше в восьми участках, чем в двух или трех (при использовании гибридизационного зонда), достаточных для ПЦР», — объясняет исследователь.
Во время предшествующей эпидемии SARS возбудителя выявляли с помощью реакции NASBA (амплификации на основе секвенирования нуклеиновых кислот) и RCA (репликации по типу катящегося кольца). Геномный редактор CRISPR-Cas также пробуют применять для идентификации РНК нового коронавируса. Есть работы по полногеномному секвенированию любого генетического материала, находящегося в биоматериале. Метод очень чувствительный, но дорогой и долгий — занимает 20 часов. Так что в ближайшее время ПЦР с обратной транскрипцией останется самым массовым способом обнаружения коронавируса в организме.