В чем выражается методика определения общего микробного числа в исследуемой воде
Общее микробное число (ОМЧ)
Вода – основной природный ресурс, без которого нельзя представить существование человека на планете. Здоровье людей в заметной мере зависит от ее качества, так как она используется во многих сферах жизни, в том числе для утоления жажды, приготовления пищи, а также выполнения гигиенических процедур. Чтобы избежать возникновения каких-либо проблем, связанных с нарушениями и присутствием в жидкости вредоносных веществ и бактерий, важно знать ее химический и микробиологический состав.
В этом помогают современные возможности сертифицированных лабораторий, которые по запросу могут проводить санитарно-микробиологические мероприятия, осуществляемые в плановом и внеплановом порядке. Их основная цель – контроль общих и специальных эпидемиологических показателей. Основных объектов для таких исследований несколько:
Для каждого типа справедливо большое количество различных показателей, среди которых следует выделить микробиологические. Учитывая, что выявление бактерий с патогенными свойствами в ходе биологического анализа – задача очень непростая, а в некоторых случаях невыполнимая, одним из ключевых показателей биологической загрязненности может стать число бактерий, присутствующее в 1 миллилитре воды. В профессиональной среде его принято называть общим микробным числом.
Подробнее об ОМЧ
Общее микробное число, имеющее аббревиатуру ОМЧ, представляет собой количественный показатель, который отражает общее количество микроорганизмов с анаэробными и аэробными свойствами в 1 мл изучаемого образца воды. Речь прежде всего о тех микроорганизмах, которые не видны невооруженным глазом при образовании колоний.
Несмотря на то, что данное тестирование не так часто используется для индикации наличия патогенных бактерий, оно представляет собой важный санитарный показатель, позволяющий определить степень обсемененности объекта, повергающегося анализу. С его помощью можно вовремя отреагировать на резкое увеличение числа колоний, которое при превышении допустимого порога указывает на создание оптимальных условий для развития патогенных форм бактерий.
Определение ОМЧ как часть бактериологического анализа
Фактически ОМЧ – это показатель качества воды, отражающий суммарное число микробов, свидетельствующих о степени загрязнения. Чтобы оперативно протестировать санитарное состояние систем водоподготовки, осуществляется бактериологический анализ воды, при котором в первую очередь рассматриваются динамические значения.
Также анализ часто применяется при необходимости оперативной проверки работы систем дезинфекции и водоподготовки. Для осуществления данной процедуры используется динамика значений в определенных точках отобранных проб воды, а не их абсолютные показатели. Сравнение показателя ОМЧ, которые устанавливаются при температурах 22 и 37 градусов, позволяет определить состояние процессов самостоятельной очистки природных водоемов.
ОМЧ может использоваться для того, чтобы убедиться в отсутствии загрязненности и нарушений, а также в пригодности воды для дальнейшего изготовления напитков и пищевых продуктов. Это связано с тем, что в них количество бактерий должно быть минимальным.
Популярность и эффективность методики позволяет в дальнейшем сравнивать получаемые данные при условии регулярного повторения процедуры отбора проб. Это позволит оперативно обнаружить возможные отклонения.
Единицей измерения в случае с общим микробным числом является КОЕ/мл – данное значение указывает на общее значение гетеротрофных бактерий, которые вырастают в течение суток при температуре около 37 градусов. Если температура составляет 22 градуса, время исследования увеличивается до 72 часов. Нормой установлена предельно допустимая концентрация ОМЧ в питьевой воде, уровень которого не должен превышать 50 КОЕ/мл. В случае с нецентрализованным – 100 КОЕ/мл.
Определение общего микробного числа
При выделении бактерий чаще всего используется метод мембранной фильтрации. Данный способ очень популярен в лабораториях и испытательных центрах за счет своей эффективности и высокой точности получаемых данных. Также он отличается экономичностью и простотой, требуя минимальных затрат.
Анализ необходимо проводить в нескольких случаях:
Своевременное исследование с периодическим повторением процедуры позволит выявить степень опасности употребления жидкости из конкретных источников и тем самым обезопасить людей от возможного негативного влияния патогенных микроорганизмов. Важно отметить, что анализ проводится только в специализированных лабораториях, оснащенных необходимым оборудованием и имеющих соответствующее разрешение на проведение подобных процедур.
Важность правильной подготовки к проведению анализа
Прежде чем приступить к выполнению анализа, важно позаботиться о том, чтоб пробы были взяты с соблюдением установленных правил, так как их нарушение может привести к порче образцов и искажению результатов. Также важно обеспечить оптимальные условия доставки проб, в том числе исключив добавочное загрязнение, а также возможность размножения или отмирания микроорганизмов. Для этого рекомендуется доверить выполнение данных операций специалистам, которые имеют соответствующий опыт и квалификацию.
Принцип метода мембранной фильтрации
Принцип самого метода достаточно понятен: образец пропускается через мембранный фильтр, который может иметь разный диаметр пор. Далее фильтр вместе с задержавшимися на нем микроорганизмами помещается в чашку Петри на питательную среду, после чего инкубируется при строго определенное температуре (не выше 37 градусов) в течение 24-48 часов. В таких условиях осуществляется процесс инкубирования, приводящий к заметному росту микроорганизмов и образованию их колоний, которые можно определить при помощи специального оборудования.
Фильтрование – один из самых ответственных процессов в рамках микробиологического исследования. От того, насколько правильно подобран фильтр и оборудование во многом зависит результат анализа и его точность. На основании многочисленных проводимых исследований удалось определить, что для достижения максимального развития микроорганизмов, которые задерживаются на фильтре, в качестве фильтрационного материала рекомендуется применять эфиры целлюлозы.
Учитывая, что метод в данном случае направлен на определение общего числа колоний, судить о наличии патогенных микроорганизмов на основании полученных результатов однозначно нельзя. Однако, при обнаружении высокого микробного числа, можно установить факт бактериологической загрязненности и высокой вероятности присутствия в воде патогенных бактерий. Именно поэтому он незаменим при необходимости обнаружения массового загрязнения микробами.
Классификация обнаруженных микроорганизмов
В случае, когда необходимо определить, какие конкретно бактерии присутствуют в воде, потребуется выполнение дополнительных процедур, которые позволят классифицировать микроорганизмы по характерным признакам, в том числе цвету колоний и их форме. В дальнейшем производятся мероприятия, направленные на подбор и установку очистных систем, которые позволят стабилизировать состав воды и вернуть ее к нормальному состоянию.
При помощи микробиологического анализа с применением метода мембранной фильтрации помимо общего микробного числа можно определить два вида бактерий – колиформные бактерии и термотолератные колиформные бактерии. Оба вида микроорганизмов являются индикаторами качества воды и свидетельствуют о нарушениях.
Заказ услуги в лаборатории «НОРТЕСТ»
Определение общего микробного числа в воде в лаборатории «НОРТЕСТ» – это гарантия быстрого выполнения задачи, а также точности результатов исследований. Наш испытательный центр использует современное оборудование и проверенные методики, а в штате работают только квалифицированные сотрудники с большим опытом проведения анализов любого уровня сложности.
Мы предоставляем услуги комплексного исследования, в которое входит также отбор проб, их последующая доставка, хранение и непосредственно проведение анализа. Итоговый результат заносится в протокол по утвержденной форме. Таким образом выданный нами документ будет иметь юридическую силу и в дальнейшем использоваться для предоставления в государственные службы и организаций. Это может потребоваться в случае, если придется доказывать несоответствие качества воды установленным стандартам.
12. САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОДЫ
Цель работы: изучение методов оценки санитарнобактериологического состояния питьевой воды и воды из естественных водоемов.
Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям, предъявляемым к питьевой воде действующими нормативными документами. Безопасность воды в эпидемиологическом отношении определяют по общему числу микроорганизмов и количеству бактерий группы кишечных палочек в ее определенном объеме.
Качество воды централизованных систем питьевого водоснабжения определяют в соответствии с санитарными правилами и нормами. Питьевая вода должна быть безопасна в эпидемиологическом и радиационном отношениях, безопасна по химическому составу и иметь благоприятные органолептические свойства (табл. 12.1).
Таблица 12.1. Безопасность питьевой воды в эпидемиологическом отношении (по микробиологическим и паразитологическим показателям) СанПиН 2.1.4.1074-01
Общее микробное число (ОМЧ)
Число КОЕ в 1 см 3
Термотолерантные колиформные бактерии
Число бактерий в 100 см 3
Общие колиформные бактерии
Число бактерий в 100 см3
Число БОЕ* в 100 см 3
Споры сульфитредуцирующих бактерий
Число спор в 20 см 3
Число цист в 50 дм 3
12.1. Отбор проб и подготовка их к анализу
Воду для санитарно-бактериологического контроля отбирают в количестве 500 см 3 в бутылки, предварительно простерилизованные в бумажных пакетах, с ватно-марлевой пробкой, покрытой сверху бумажным колпачком.
Перед отбором пробы кран или край трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 мин воду спускают, затем производят отбор пробы. Вода подлежит анализу не позже чем через 2 ч после отбора.
Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором, так как под действием хлора микробы в воде погибают. В качестве дехлоратора используют серноватистый натрий из расчета 10 мг на 500 см исследуемой воды.
К отобранным пробам воды прилагают сопроводительный документ с указанием соответствующих данных. Доставку проб питьевой воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре от 4 до 10 °С.
12.2. Определение общего микробного числа воды
Определение микробного числа указанным методом позволяет выявить лишь мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы.
12.3. Определение содержания колиформных бактерий в воде
В качестве СПМ наибольшее значение имеют бактерии группы кишечных палочек (БГКП). К группе кишечных палочек относят колиформные бактерии родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia.
При определении количества СПМ в воде используют следующие характеристики:
Колиформные бактерии определяют в воде методом мембранных фильтров или бродильным методом.
Бродильный метод. Сущность бродильного метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды, инкубации
посевов при температуре 37 °С в средах накопления с последующим высевом на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и определением наиболее вероятного числа БГКП в 1 дм 3 воды.
Обработка результатов анализа. По окончании инкубации посевы просматривают и делают следующие выводы:
а) при отсутствии газообразования и изменения цвета среды дают отрицательный ответ на наличие БГКП в исследуемом объеме воды, дающим право закончить исследование через 24 ч;
б) при образовании кислоты и газа производится высев материала из бродильных сосудов на среду Эндо. Высев делается бактериологической петлей густым штрихом для получения изолированных колоний. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч. После инкубации посевы просматривают. Отсутствие на среде Эндо характерных для кишечных палочек колоний дает основание на выдачу отрицательного ответа и окончание исследования;
в) при обнаружении на среде Эндо лактозоположительных темно-красных колоний, с металлическим блеском или без него, необходимо установить принадлежность выросших микроорганизмов к семейству кишечных бактерий. С этой целью производится микроскопирование препарата из колоний и постановка оксидазного теста.
Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonodaceae и других водных сапрофитов, которые, в отличие от кишечных бактерий, вырабатывают фермент оксидазу.
Для постановки оксидазного теста со среды Эндо снимают петлей по 2-3 колонии каждого типа. Микробную массу наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную специальным реактивом (30 г α-д-нафтола растворяют в 2,5 см 3 этанола, прибавляют 7,5 см 3 дистиллированной воды и 40 мг диметил-парафенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением).
При отрицательном результате оксидазного теста бумага при контакте с колонией цвета не меняет. Если же бумага синеет в течение 1 мин при контакте с колонией, то оксидазный тест считают положительным.
Наличие в препарате грамотрицательных неспорообразующих палочек, не обладающих оксидазной активностью, позволяет немедленно дать ответ о наличии в воде БГКП.
После проведения анализа записывают в лабораторный журнал окончательные результаты (положительные и отрицательные) по каждому засеянному объему и определяют коли-титр и коли-индекс.
Метод мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с последующим выращиванием их на среде Эндо при температуре 37 °С, дифференцированием выросших колоний и подсчетом количества БГКП в 1 см 3 воды.
Подготовка мембранных фильтров. Для фильтрования воды отбирают мембранные фильтры № 3, помещают их в подогретую до температуры 80 °С дистиллированную воду и ставят на небольшой огонь для кипячения. Кипячение проводят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают, а после третьего фильтры оставляют в воде до употребления.
Рис. 12.1. Определение количества микроорганизмов методом мембранных фильтров
Обработка результатов анализа. По окончании инкубации посевы просматривают и делают следующие выводы:
а) отсутствие микробного роста на фильтрах или обнаружение на них колоний, не характерных для БГКП, позволяет закончить исследования на этом этапе анализа с выдачей отрицательного результата на присутствие БГКП в анализируемом объеме воды;
б) при обнаружении на фильтре колоний, характерных для БГКП, исследование продолжают. Из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Отсутствие в мазках мелких грамотрицательных неспороносных палочек является основанием для прекращения анализа с выдачей отрицательного результата на присутствие БГКП в исследуемом объеме воды;
в) при наличии в мазках грамотрицательных палочек, морфологически сходных с кишечными, ставится оксидазная проба. При обнаружении на мембранных фильтрах однотипных лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него), не вырабатывающих оксидазы, анализ воды на этом этапе заканчивают и подсчитывают число выросших на мембранном фильтре колоний кишечных палочек. Результат выражают в виде коли- индекса в пересчете на 1 дм 3 воды;
г) при обнаружении на мембранных фильтрах розовых и бесцветных колоний подсчитывают их число и пересевают 2-3 изолированные колонии каждого типа в глюкозо-пептонную среду Эйкмана. После инкубации в течение 3-4 ч при температуре 37 °С отмечают изменение цвета среды за счет образования кислоты и накопления газа в поплавке. В этом случае результат считается положительным. Если изменений в среде нет, то дают отрицательный результат на присутствие БГКП.
Контрольные вопросы
1. Какие Вы знаете показатели эпидемиологической безопасности питьевой воды?
2. Что такое общее микробное число, колититр и колииндекс?
3. Какие роды микроорганизмов входят в БГКП?
4. Какими методами определяют колиформные бактерии?
5. Каковы основные критерии, по которым устанавливают присутствие колиформных бактерий в питьевой воде?
6. С какой целью проводят тест на оксидазу?
Основы санитарной микробиологии (стр. 7 )
 | Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 |
Исследование воды должно быть проведено как можно быстрее, максимальный срок хранения проб до анализа (включая транспортировку) 8 часов при температуре 5±3°С. При более длительном и неправильном хранении может наступить размножение или гибель микрофлоры.
Определение общего микробного числа.
Сущность метода заключается в определении в 1 см3 воды общего содержания мезофильных аэробов и факультативных анаэробов, способных расти на питательном агаре данного состава при температуре 37°С в течение 24 ч, образуя колонии, видимые при увеличении в 2-5 раз.
Определение общего микробного числа воды можно проводить методом серийных десятикратных разведений с посевом на мясопептонный агар (МПА) и методом прямого микроскопического подсчета микроорганизмов в исследуемой воде.
При определении первым методом производят посев проб воды на питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний.
Объем воды для посева выбирают с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, воду открытых водоемов – в объемах 1; 0,1 и 0,01 мл. Для посева 0,1 см3 и меньших объемов воды используют разведения анализируемой воды. Для этого в пробирку с 9 см3 стерильной воды вносят 1 см3 анализируемой воды. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 см3 и переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1 см3 анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов воды этой же пипеткой переносят 1 см3 содержимого первой пробирки в следующую с 9 см3 стерильной воды. Посев 1 см3 из второй пробирки будет соответствовать посеву 0,01 см3 анализируемой воды и т. д.
С флаконов с пробой воды снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют, после чего воду тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку.
Засев каждого разведения проводят глубинным способом. Для этого стерильной пипеткой отбирают по 1 мл воды и вносят в 2 стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку. После внесения воды в чашки Петри ее заливают 10-12 см3 остуженного питательного агара. Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат и выращивают при 37°С в течение 24 ч.
Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при температуре 37° С в течение 24 ч, а другую – при 20-22°С 48 ч. При температуре 20°С вырастает большее количество сапрофитов и именно они являются наиболее активными участниками процесса самоочищения водоема. В местах большого загрязнения сточными водами численное значение обеих групп сапрофитов близко, поэтому динамика численности этого показателя считается чувствительным индикатором загрязнения водоемов, особенно органическими веществами.
Для выявления плесневых и дрожжевых грибов исследуемую воду засевают по 0,5 мл на среду Сабуро и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 — 4 сут. Подсчитывают число выросших колоний и также рассчитывают среднее арифметическое. Результат (ОМЧ) вычисляют путем суммирования среднего арифметического числа бактерий, дрожжевых и плесневых грибов и выражают в КОЕ/мл.
Учет результатов. Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают с помощью лупы с увеличением в 2-5 раз или прибора для счета колоний. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон. Для большей точности счета каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.
Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашке выросло от 30 до 300 колоний. При посеве 1 см3 неразведенной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие 300. Если в чашке с наиболее высоким разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, то допускается подсчитывать колонии с помощью пластинки с сеткой и лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью 1 см2 каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое число колоний на 1 см2, значение которого умножают на площадь чашки в см2, вычисленную по формуле: S = πr2.
Результат подсчета колоний в каждой чашке выражают в количестве бактерий на 1 см3 анализируемой воды с учетом посеянного объема. За окончательное количество бактерий принимают среднее арифметическое результатов подсчета на двух параллельных чашках или разных разведений. Результаты округляют следующим образом: если результат находится в пределах чисел от 1 до 100, то записывают те числа, которые получены; если результат находится в пределах чисел от 101 до 1000, то результат округляют до 10; если результат находится в пределах чисел от 1001 до 10000, то результат округляют до 100 и т. д.
Количество колоний учитывают, ориентируясь на одну чашку, в случаях: если на другой чашке при посеве из разведения выросло менее 20 колоний; при ползучем росте бактерий, распространившихся на всю поверхность чашки или значительные зоны, маскирующем рост других колоний; при количестве колоний свыше 300.
Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете количества колоний, когда на обеих чашках отмечен ползучий рост. При этом просчитывают квадраты на свободных от сплошного роста местах чашки.
Прямой микроскопический метод определения общего количества микроорганизмов заключается в концентрации бактерий на мембранных фильтрах (при пропускании через них исследуемой воды), последующем окрашивании эритрозином и микроскопировании.
Прямой метод удобен тем, что результат, т. е. количество микроорганизмов в 1 мл воды, может быть получен в течение нескольких часов. Поэтому рекомендуется использовать прямой метод, если необходимо дать быструю санитарную оценку воды: при оценке процесса естественного самоочищения водоемов, при оценке эффективности работы очистных сооружений на всех этапах и т. д. Для фильтрования воды используют мембранные фильтры, фильтр Зейтца или специальный аппарат Долгова-Разумова.
Мембранный фильтр с окрашенными микроорганизмами высушивают и помещают на предметное стекло, предварительно капнув каплю иммерсионного масла на стекло и на фильтр, который накрывают тонким покровным стеклом. Микроскопируют с иммерсионным объективом, в окуляр вкладывают сетчатый микрометр, разделенный на мелкие квадраты. Подсчитывают микроорганизмы в 20 полях зрения (в каждом поле зрения в 4 маленьких квадратах, расположенных по диагонали). Расчет общего количества бактерий в 1 мл (X) ведется по формуле:
Определение колиформных бактерий (БГКП).
Количество колиформных бактерий выражают в виде коли-титра или коли-индекса. Коли-титр воды – минимальное количество БГКП в 1 л воды. Коли-индекс воды – количество БГКП в 1 л воды.
Для определения этих показателей используют метод мембранных фильтров и титрационный (бродильный) метод.
Исследование воды методом мембранных фильтров. Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим признакам.
Перед использованием мембранные фильтры проверяют на отсутствие трещин, отверстий, пузырей и кипятят в дистиллированной воде в течение 10 мин (при этом нельзя допускать скручивания фильтров). Для полного удаления из фильтров остатков растворителей, которые применяются при их изготовлении, кипячение следует повторить 3-5 раз со сменой дистиллированной воды. Подготовленные таким образом фильтры сохраняются в банках с дистиллированной водой или в сухом виде. В день постановки опыта фильтры повторно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 10 мин.
Фильтрование производят с помощью специальных приборов или фильтра Зейтца. Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора. Отросток колбы, в которую фильтруется вода, с помощью резиновой трубки соединяют с водоструйным или масляным насосом для создания вакуума в приемном сосуде (около 0,25 атм).
Объем пробы воды зависит от целей исследования. При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, и в наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее 333 см3, профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.