В чем выражается специфичность действия фага
В чем выражается специфичность действия фага
Частица фага является нуклепротеидом и состоит из белка (50-60%) и ДНК (45-50%). Некоторые фаги содержат небольшое количество липоидов (1,5-2%). Белок образует оболочку фага, а ДНК находится во внутреннем пространстве головки фага. Белковая оболочка состоит из большого числа белковых частиц, называемых субъединицами.
2«>
Рис. 47. Размеры и строение фага Т2
Для получения фага материал, содержащий его (вода, почва, испражнения, гной и пр.), высевают на жидкую питательную среду. В термостате на питательной среде вырастают бактерии, и в них начинают размножаться соответствующие фаги. Выросшую культуру фильтруют через бактериальный фильтр. Бактерии остаются на фильтре, а фаг переходит в прозрачный фильтрат. Если этот фильтрат прибавить к свежей бульонной культуре соответствующих бактерий, то фаг разрушит тела бактерий и культура посветлеет. На сплошном налете бактерий на твердой питательной среде наблюдаются пустые прозрачные круглые пятна. В этих пятнах находятся размножившиеся в клетках бактерий и лизировавшие их частицы фага. Такие пятна называются бляшками или негативными колониями фага. Если с этих бляшек петлей посеять в культуру чувствительного микроба, то опять произойдет явление бактериофагии.
Фаги более устойчивы к действию физических и химических факторов, чем неспороносные бактерии. В запаянных пробирках фаги могут сохраняться годами. Большинство фагов инактивируется при 65-75°. Фаги очень чувствительны к действию кислот и устойчивы к действию антибиотиков.
Но специфичность фага относительна. Фаг можно адаптировать (приспособить) к паразитированию на другом виде бактерий путем многократных пересевов с клетками одного вида бактерий. Например, брюшнотифозный фаг можно адаптировать к дизентерийной палочке с наследственной потерей свойства лизировать брюшнотифозную палочку. Некоторые клетки чувствительной к фагу культуры могут приобрести устойчивость к разрушающему действию фага с передачей этого свойства по наследству. Образование фагоустойчивых культур бактерий происходит часто в результате мутаций.
Фаги проходят те же четыре фазы развития, что и вирусы. Фаг прикрепляется к клетке своим отростком, а не головкой. На конце отростка имеются длинные (130 ммк), но очень тонкие (2 ммк) белковые нити, которые улавливают в среде бактерии. Фаг прикрепляется к клетке бактерии особыми присосками на конце отростка.
В отростке фага имеется фермент типа лизоцима и молекула богатого энергией аденозинтрифосфата. Фермент разрыхляет оболочку бактерийной клетки, кончик отростка сжимается благодаря энергии АТФ и, как микрошприц, впрыскивает нуклеиновую кислоту фага в клетку. Белковая же оболочка остается снаружи бактерийной клетки и дальнейшего участия в развитии фага не принимает.
В следующей фазе, в первой ее половине, нуклеиновая кислота, проникшая в бактерийную клетку, не обнаруживается. В это время она, по-видимому, включается в генетический аппарат клетки и перестраивает клеточные механизмы синтеза, направляя их на производство фаговой нуклеиновой кислоты и фагового белка. О ходе созревания фагов в этот период стало известно в результате изучения сверхтонких срезов бактерийных клеток, инфицированных фагом, так как цельные клетки оказались очень толстыми для просматривания внутренних структур, в том числе и фагов, в электронный микроскоп. В тонких ультрасрезах было найдено, что сначала в различных участках протоплазмы клетки идет образование нуклеиновой кислоты, белковой головки и отростков. Затем, так сказать, детали в конце фазы объединяются и образуются зрелые фаги.
Освободившиеся из бактерийной клетки молодые фаги сразу начинают внедряться в другие клетки бактерий. Такой процесс происходит при благоприятных условиях, например, в пробирке с чувствительной культурой бактерий, до тех пор пока не будут лизированы все микробные клетки бактерий, пока не наступит стационарная фаза развития культуры.
Не всегда последняя фаза кончается разрушением бактерийной клетки фагом. При взаимодействии фага и клетки можно наблюдать самые разнообразные изменения клетки бактерии, не приводящие ее к гибели. Происходит изменение морфологии, вирулентности, биохимических свойств, приобретение фагоустойчивости и др. Фаги легко изменяются под влиянием внешних условий. Могут изменяться их морфологические, антигенные свойства: форма бляшек на твердых средах, адаптирование к другим типам и видам бактерий. Фаг легко подвергается мутационной изменчивости.
Но существует еще другой, особый тип взаимоотношений фага с клеткой. Как патогенные микробы могут иногда вызывать не только различной тяжести заболевания, но и скрытое, латентное течение заболевания, так и фаги, которые не вызывают гибели клеток, долгое время существуют в них в латентном (скрытом) состоянии. Такие фаги называются умеренными или неинфекционными. Взаимодействие умеренного фага с микробной клеткой выражается в лизогенизации бактериальной культуры. В лизогенных культурах наблюдается своеобразный симбиоз бактериальной клетки с фагом, при котором возможно сохранение и бактериальной клетки, и фага. Фаг не препятствует обменным реакциям и размножению бактериальных клеток в культуре. При делении бактериальной клетки фаг также переходит в обе новые клетки. Все это происходит в многочисленных поколениях. Фаг в них теснейшим образом связан с клеткой, но находится в неактивном, неинфекционном состоянии. Такой фаг А. Львов назвал профагом. Он не обнаруживается даже с помощью электронного микроскопа.
Лизогения широко распространена в природе. У стафилококков, брюшнотифозных бактерий и у многих других почти каждый штамм является лизогенным. Большинство свежевыделенных культур от животных, растений и из почвы являются уже лизогенными.
Для победы над раком надо раскрыть основной механизм превращения нормальной клетки в злокачественную опухолевую. Этот механизм связан с нарушением синтеза белка, а следовательно, с изменениями в строении и функции нуклеиновой кислоты.
Фаг лизогенных культур может оказывать большое влияние на биологию бактерий, определять их свойства. Так, найдено, что некоторые фаги, выделенные из токсигенных лизогенных дифтерийных культур, при внедрении в нетоксигенные дифтерийные палочки превращают их в токсигенные, т. е. вырабатывающие дифтерийный токсин, вызывающий дифтерию человека (лизогенная конверсия). И это новое свойство уже передается по наследству. Фаги некоторых жгутиковых микробов могут вызывать у неподвижных бактерий образование жгутиков. Это явление называется трансдукцией.
В чем выражается специфичность действия фага
Бактериофаги [от бактерии, + греч. phagein, поедать] — группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. Вирусы, вызывающие гибель инфицированных бактерий, известны как литические бактериофаги. Размножение и выход дочерних популяций вируса из бактерии сопровождается её гибелью и разрушением (лизисом). Бактериофаги широко распространены в природе — их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека. Принципы классификации бактериофагов аналогичны подходам к систематике вирусов вообще.
В основу классификации положены антигенная структура, морфология фагов, спектр действия, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНК-содержащим вирусам с нуклео-капсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. По спектру действия выделяют типовые фаги (Т-фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов. Бактериофаги устойчивы к различным физическим и химическим воздействиям. Большинство из них без вреда переносит высокие температуры (50-70 °С), действие дезинфектаитов (за исключением кислот и формалина), прямой солнечный свет и УФ-облучение в низких дозах. Бактериофаги проявляют иммуногенные свойства, вызывая синтез специфических AT.
Рис. 5-10. Фаг Т4 кишечной палочки до контакта с бактерией (А) и в момент введения фаговой ДНК (Б).
Морфология бактериофагов. Типы бактериофагов
Строение бактериофагов наиболее полно охарактеризовано на основе изучения Т-фагов кишечной палочки (рис. 5-10). Внешне большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды или головастиков, но среди них встречают и другие формы, на основании которых выделяют пять основных типов бактериофагов.
• К типу I бактериофагов относят ДНК-содержащие нитевидные фаги, лизирующие бактерии, содержащие F-плазмиды.
• Фаги типа II представлены головкой и рудиментом хвоста. Геном большинства из них образован молекулой РНК и лишь у фага jc-174 — однонитевой ДНК.
• Бактериофаги типа III имеют короткий хвост (например, Т-фаги 3 и 7).
• К типу IV относят фаги с несокращаюшимся хвостом и двухнитевой ДНК (например, Т-фаги 1 и 5).
• Фаги типа V имеют ДНК-геном, сокращающийся чехол хвоста, который заканчивается базаль-ной пластиной (например, Т-фаги 2 или 4).
Вопрос 44. Бактериофаги
1. Понятие о бактериофагах
2. Классификация бактериофагов
3. Диагностическая и терапевтическая роль фагов
1. Бактериофаги (фаги) — это вирусы, поражающие бактериальные клетки (в качестве клетки-хозяина). Вирионы фагов состоят из головки, содержащей нуклеиновую кислоту вируса, и более или менее выраженного отростка. Нуклеокапсид головки фага имеет кубический тип симметрии, а отросток — спиральный тип, т. е. бактериофаги имеют смешанный тип симметрии нук-леокапсида.
По характеру взаимодействия фага с клеткойвсе бактериофаги делятся:
• на вирулентные (литические), вызывающие продуктивную инфекцию и лизис бактериальной клетки;
• умеренные, вызывающие латентную инфекцию и ассоциацию генома вируса с бактериальной хромосомой. Умеренные фаги, в отличие от вирулентности, не вызывают гибели бактериальных клеток и при взаимодействии с ней переходят в неинфекционную форму фага, называемую профагом. Профаг— геном фага, ассоциированный с бактериальной хромосомой. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке в неограниченном числе поколений. Бактериальные клетки, содержащие в своей хромосоме профаг, называются лизогенными. Профаг в лизогенных бактериях самопроизвольно или под влиянием различных индуцированных агентов может переходить в вегетативный фаг. В результате такого превращения бактериальная клетка лизируется и продуцирует новые фаговые частицы. В ходе лизогенизации бактериальные клетки могут дополнительно приобретать новые признаки, детерминируемые геномом вируса. Такое явление — изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага — называется фаговой, или лизогенной, конверсией (проявление вирус-инду-цироанной трансформации).
Наборы таких типоспецифических фагов используются для дифференцировки бактерий внутри вида — это метод фаготи-пирования бактерий. С помощью этого метода можно установить источник и пути передачи инфекционного заболевания, т. е. провести его эпидемиологический анализ, поскольку он позволяет сравнивать фаготипы (фаговары) чистых культур бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования от больного и от окружающих его лиц — возможных бактерионосителей.
Фаги получают индукцией из лизогенных культур или из объектов, содержащих соответствующие бактерии, при культивировании на жидкой питательной среде с последующим выделением из культуральной жидкости путем фильтрования через бактериальные фильтры. Активность полученного (выделенного) фага определяют путем титрования или определения количества фаговых частиц в единице объема среды методом агаровых слоев по Трациа. Суть его состоит в том, что на газон чувствительной культуры (первый слой) наносят определенное разведение фага в полужидком агаре (второй слой). Каждая фаговая частица, размножаясь на бактериальном газоне, образует на поверхности выросшей культуры стерильное пятно («бляшка», или негативная колония фага). Таким образом, по количеству стерильных пятен можно подсчитать количество фаговых частиц в единице среды (титр фага).
3. Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологических исследования. Однако чаще всего их используют для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний (перорально или местно). Активность фага выражают числом частиц фага, содержащихся в 1 мл или 1 таблетке. Лечебное и профилактическое действие фагов основано на их литической активности.
Отличительной чертой бактериофагов как терапевтических средств является почти полное отсутствие у них побочного действия, что позволяет назначать эти препараты различным возрастным группам без каких-либо ограничений, и возможность назначения поливалентных бактериофагов до получения результатов бактериологического исследования. Препараты диагностических бактериофагов вводить категорически запрещается. В настоящее время в России для фаготерапии и фагопрофилактикипроизводятся и используются:
• поливалентный сальмонеллезный бактериофаг;
• моновалентные бактериофаги — брюшнотифозный, дизентерийный, протейный, синегнойный, холерный, стафилококковый, стрептококковый, коли-фаг (кишечной палочки);
• комбинированные препараты поливалентных бактериофагов — колипротейный, пиобактериофаг (включающий стафилококковые, стрептококковые, клебсиеллезные, эшерихиозные, протейные и синегнойные бактериофаги) и др.
В чем выражается специфичность действия фага
История открытия и изучения фага. В 1898 г. Н. Ф. Гамалея показал, что фильтрат сибиреязвенных бацилл вызывает лизис свежих культур этих микроорганизмов. В 1915 г. Ф. Ту орт обнаружил, что белые непрозрачные колонии стафилококков становились прозрачными и исчезали и что агент, лизирующий стафилококки, проходит через бактериальные фильтры, сохраняя способность растворять свежие культуры этих микроорганизмов. Явление лизиса микроорганизмов было описано, но природа его не изучена. Вот почему честь открытия бактериофага принадлежит канадскому ученому д’Эреллю.
Д’Эрелль (1917) изучал фильтраты испражнений, которые брал ежедневно у больного дизентерией и вносил в пробирки со свежезасеянной культурой возбудителя этой болезни. После инкубации в термостате культура вырастала. Но однажды она не выросла, а растворилась. Это совпало с началом выздоровления больного.
Д’Эрелль показал, что лизирующая способность фильтратов испражнений усиливалась при последовательных пассажах на свежих культурах бактерий. Из этого ученый сделал вывод, что растворяет их живой агент, проходящий через бактериальные фильтры, т. е. вирус. В настоящее время его точка зрения принята большинством ученых.
* ( В настоящее время чаще употребляют термин «фаг», так как подобные «пожиратели» встречаются также у грибов и водорослей.)
С открытием электронного микроскопа была подтверждена корпускулярная природа фага и изучена его морфология.
Открытие д’Эрелля привлекло внимание врачей, применивших фаг для лечения и профилактики ряда инфекционных болезней. В настоящее время фаги широко используют в медицинской практике и при различных биологических исследованиях. Фагами занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии и т. д. Изучение фага продолжается, как одна из интереснейших глав биологии.
Свойства фагов
Морфология фагов. Большинство фагов состоит из головки и хвостового отростка, поэтому их сравнивают с головастиками или сперматозоидами. Наиболее изучены Т-фаги кишечной палочки (рис. 21). Их отросток представляет собой полый цилиндр (стержень), покрытый чехлом и заканчивающийся базальной пластинкой с шипами и фибриллами. Размеры фагов, форма и величина головки, длина и строение отростка различны у разных фагов. Например, встречаются фаги с длинным отростком, чехол которого не сокращается, фаги с коротким отростком, без отростка и нитевидные (рис. 22).
Химический состав фагов. Как и все вирусы, фаги состоят из нуклеиновой кислоты одного типа (чаще встречаются ДНК-фаги) и белка. Молекула нуклеиновой кислоты, скрученная в спираль, находится в головке фага. Оболочка фага (капсид) и отросток имеют белковую природу. На свободном конце отростка содержится литический фермент, обычно лизоцим или гиалуронидаза.
В отличие от лизиса изнутри лизис извне происходит тогда, когда на клетке адсорбируется сразу очень большое количество фагов. Они проделывают в клеточной стенке многочисленные отверстия, через которые вытекает содержимое клетки. Таким образом при лизисе извне фаг не размножается, и количество его частиц не увеличивается.
По характеру действия на микроорганизмы различают вирулентные и умеренные фаги.
Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции. С частью из них фаги вступают в симбиоз: нуклеиновая кислота фага (его геном) встраивается в хромосому клетки и получает название про фаг. Происходит образование единой хромосомы. Бактериальная клетка при этом не погибает. Профагу ставший частью генома клетки, при ее размножений может передаваться неограниченному числу потомков, т. е. новым клеткам. Явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) носит название лизогения, а культура, в которой имеется профаг, называется лизогенной. Это название отражает способность профага спонтанно покидать хромосому клетки и, переходя в цитоплазму, превращаться в вирулентный фаг. Те клетки культуры, в которых образовался вирулентный фаг, погибают (лизируются), остальные сохраняют лизогенность.
Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они устойчивы к повторному заражению одноименным фагом. При действии на лизогенную культуру проникающего излучения (определенных доз и экспозиции рентгеновских, космических лучей), некоторых химических веществ и ряда других факторов продукция вирулентного фага и лизис им клеток культуры значительно увеличиваются.
Умеренные фаги могут принести вред микробиологическому производству. Например, если штаммы-продуценты вакцин, антибиотиков и других биологических веществ оказываются лизогенными, существует опасность перехода умеренного фага в вирулентный, что повлечет за собой лизис производственного штамма.
Умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микроорганизмов. Профаг может изменить некоторые свойства микробной культуры, например сделать ее способной к токсинообразованию, что наблюдается среди дифтерийных палочек, возбудителя скарлатины и др. Кроме того, переходя в вирулентную форму и лизируя клетку, фаг может захватить часть хромосомы клетки-хозяина и перенести эту часть хромосомы в другую клетку, где фаг снова перейдет в профаг, а клетка получит новые свойства (см. главу 10).
Распространение фагов в природе повсеместное. Фаги встречаются там, где находятся чувствительные к ним микроорганизмы: в воде, почве, сточных водах, выделениях человека и животных и т. д. Почти все известные бактерии являются хозяевами специфических для них фагов.
Устойчивость фагов к физическим и химическим факторам выше, чем у вегетативных форм их хозяев. Фаги выдерживают нагревание до 75° С, длительное высушивание, рН от 2,0 до 8,5. Они не чувствительны к антибиотикам, тимолу, хлороформу и ряду других веществ, уничтожающих сопутствующую микрофлору. Поэтому эти вещества используют при выделении и сохранении фагов. Кислоты и дезинфицирующие вещества губительны для фагов.
Контрольные вопросы
1. Дайте определение понятию фаг.
2. Кто впервые наблюдал действие фага? Кто открыл фаг и изучил его природу?
3. Какова природа, химический состав и строение фагов?
4. В чем выражается специфичность действия фага?
5. Чем отличается действие вирулентного и умеренного фагов?
Методы изучения вирулентных фагов
Подготовка материала
Материалом, из которого выделяют фаг, обычно являются фильтраты, полученные с помощью бактериальных фильтров из объектов внешней среды, органов и выделений человека и животных, культур микроорганизмов и т. д.
Перед фильтрацией исследуемый материал подготавливают следующим образом:
Жидкости (кровь, мочу, воду, смывы с предметов и т. п.) освобождают от крупных частиц с помощью бумажного фильтра или центрифугированием, чтобы они не забили поры бактериального фильтра.
Вязкий материал (гной, кал) эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне, после чего освобождают от крупных частиц, как описано выше.
Подготовленный материал пропускают через бактериальный фильтр, освобождая от посторонней микрофлоры.
Культуры микроорганизмов (известные или изучаемые). В работе с фагом применяют 20-24-часовые культуры, выращенные на агаре, или 2-6-часовые культуры в жидких средах. Чистоту культуры устанавливают в мазках, окрашенных фуксином Пфейффера или по Граму. Из культур, выращенных на скошенном агаре, готовят взвесь. В пробирку с культурой наливают 3-5 мл изотонического раствора натрия хлорида. Вращая пробирку между ладонями, осторожно смывают культуру с поверхности среды так, чтобы не намочить пробку. Взвесь переносят в стерильную пробирку и разводят изотоническим раствором натрия хлорида 1:10 (0,5 мл взвеси в 4,5 мл раствора).
При работе с фагом необходима стерильная посуда (градуированные и пастеровские пипетки, чашки Петри, пробирки, колбы, ступки), термостат, фильтровальное устройство, центрифуга, штативы, прибор для счета колоний.
Внимание! Вся работа с фагом требует соблюдения асептики.
Качественные методы
О наличии фага в том или ином субстрате узнают по лизису чувствительной к нему микробной культуры (тест-культура).
Обнаружение фага на плотных средах. Тест-культуру засевают «газоном» (см. главу 7) на поверхность агара в чашке Петри. Посев подсушивают в термостате 30-40 мин при открытой крышке, после чего на него наносят каплю изучаемого материала. Через несколько минут, когда жидкость впитается, чашки помещают в термостат на 18-20 ч. Если в изучаемом материале есть фаг, произойдет лизис культуры и на месте, куда была нанесена капля, культура или совсем не вырастет (сплошной лизис) или образуются отдельные колонии фага.
Обнаружение фага в жидких средах. В две пробирки с одинаковым количеством бульона вносят по одной капле культуры, микроба, в отношении которого изучают фаг. В одну из них добавляют исследуемый фаг или фильтрат материала, в котором его определяют. Вторая пробирка служит контролем роста культуры. Пробирки помещают в термостат на 12-20 ч. Учет результатов производят только при наличии роста культуры в контроле (помутнение среды). Отсутствие видимого роста или последующее просветление среды в пробирке с исследуемым материалом свидетельствует о присутствии фага. Если содержимое этой пробирки мутное, исследование необходимо дополнить посевом на плотную среду: помутнение могло произойти от роста устойчивой к фагу культуры. Только в том случае, если в посеве на агар фаг не будет обнаружен, можно сделать вывод, что его нет в изучаемом материале.
Количественные методы
Активность фага выражают понятием титр, различая титр фага в жидкой и на плотной среде.
Титрование фага по Аппельману (в жидкой среде). При титровании фага объем и состав среды, температура, аэрация, количество микробов, пробирки, в которых проводят титрование (диаметр, конфигурация дна, толщина стекла), должны быть одинаковыми. Изменяется только количество фага.
Все компоненты, участвующие в биологических опытах, подлежат обязательному контролю на правильность их работы.
Постановка опыта. 1. В 12 стерильных пробирок наливают по 4,5 мл стерильного бульона. Уровень жидкости во всех пробирках должен быть одинаковым. Если это не так, значит допущена ошибка. В этом случае нестандартную пробирку заменяют новой и заново наполняют бульоном. При разливе бульона пользуются пипетками вместимостью 5-10 мл.
Таблица 9. Схема титрования фага по Аппельману
Примечание. Стрелки указывают перенос фага из пробирки в пробирку. Из пробирки 10 и из пробирки контроля фага 0,5 мл выливают в дезинфецирующий раствор.
4. Во все пробирки, кроме пробирки контроля фага, вносят по 1 капле (0,05 мл) взвеси тест-культуры. Пробирки встряхивают. Во всех пробирках, кроме пробирки контроля фага, должна появиться слегка заметная муть. Если этого не происходит, все операции с нестандартной пробиркой повторяют вновь.
5. Пробирки помещают в термостат на 18-20 ч, после чего учитывают результат титрования. Учет результатов обязательно начинают с контролей.
Жидкость в пробирке с контролем фага должна остаться прозрачной. Этот контроль позволяет сделать вывод, что посуда, бульон и фаг стерильны.
Титрование фага по Грация (на плотной среде) методом агаровых слоев позволяет определить количество частиц фага в титруемом материале. Метод основан на том, что каждая частица фага дает зону просветления (лизиса) на чашке с газоном чувствительного к нему микроба, т. е. образует отдельную колонию.
Подсчитывать колонии лучше всего на чашках, где выросло не меньше 5 и не больше 50 колоний. В противном случае страдает точность подсчёта. Если на чашке много колоний, чашку можно разделить на несколько секторов, сосчитать колонии на одном из них и полученную цифру умножить на количество секторов.
Как правило, все биологические исследования проводят в трех параллельных опытах. В данном примере каждое разведение фага одновременно титруют трижды.
Методы выделения фагов
Прямой метод. Фаг получают и изучают непосредственно в фильтратах исследуемого материала. О наличии и активности фага узнают по лизису чувствительной к нему культуры.
Как правило, прямой метод не дает убедительных результатов из-за малого количества содержащегося в фильтрате фага. Для повышения его количества используют методы обогащения.
Метод обогащения. Подготовленный фильтрат вносят в 2-3-часовую бульонную культуру соответствующих микроорганизмов. Посев инкубируют в термостате. Фаг размножается в клетках культуры и титр его значительно увеличивается. После этого бульон фильтруют и в фильтрате определяют свойства и активность фага.
Практическое применение фагов
Применение фагов основано на их строгой специфичности и способности разрушать микробные клетки или вступать с ними в симбиоз.
Фагодиагностика включает: а) идентификацию выделенных культур с помощью известных (диагностических) фагов. Культура соответствует тому фагу, который ее лизировал. Например, если лизис вызвал холерный фаг, то это культура холерного вибриона. Строгая специфичность типовых фагов дает возможность типировать варианты внутри вида (фаговары). Фаготипирование имеет большое значение в эпидемиологии, так как позволяет установить источник инфекции и решить ряд других вопросов (см. с. 243, 292); б) определение неизвестного фага по тест-культуре микробов. Если фаг лизирует культуру возбудителя дизентерии, то это дизентерийный фаг; в) ускоренный метод диагностики с помощью реакции нарастания титра фага РНТФ не требует выделения чистой культуры возбудителя. Исследуемый материал (от больного или из объектов внешней среды) и индикаторный фаг, титр которого строго установлен, вносят в бульон. После инкубации в термостате определяют титр фага по Грациа. Увеличение титра (числа корпускул фага) в 5 раз и более говорит о том, что в исследуемом материале есть соответствующие возбудители, в которых фаг размножился.
Умеренные фаги широко применяют при решении кардинальных вопросов биологии. С их помощью изучен генетический код, достигнуты большие успехи в генной инженерии, их используют для изучения опухолевого роста, как фактор изменчивости микроорганизмов и в других исследованиях. Так как лизогенные культуры в отличие от «здоровых» чувствительны к радиации, они служат для определения надежности защиты космических кораблей от космических лучей: при ненадежной защите профаг переходит в вирулентную форму и лизирует культуру.
Препараты фагов
При производственном получении препаратов фага пользуются хорошо изученными штаммами микроорганизмов и фагов, которые обычно выращивают в реакторах, что позволяет получать большие количества фаголизата.
Фаги выпускают в жидком виде (ампулы и флаконы), в таблетках и свечах. Таблетки фагов, предназначенные для применения через рот, покрыты кислотоустойчивой оболочкой, защищающей фаги от действия соляной кислоты желудочного сока.
Все препараты фагов подлежат обязательному контролю на отсутствие посторонней флоры, безвредность и активность (титр), который осуществляется на выпускающем их производстве. Выборочный контроль производят в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Выпускаемый фаг снабжен этикеткой, на которой указано: учреждение, его выпускающее, название фага, серия, номер контроля и срок годности. Каждая упаковка снабжена наставлением по применению и хранению фага.
Контрольные вопросы
1. Какие свойства фага лежат в основе его получения и использования?
2. Почему титровать фаг необходимо в стерильных условиях?
3. С каких пробирок начинают учет опыта титрования фага по Аппельману?
Задание
1. Изучите и опишите характер действия фага на культуры микроорганизмов, выращенные на жидкой и плотной среде (культуры получите у преподавателя).
2. Проведите титрование фага по Аппельману и запишите его результаты.
3. Подсчитайте колонии фага на чашке (метод Грациа). Зная разведение фага, определите количество корпускул фага в 1 мл исходного препарата.